SPOS技術(shù)：血細(xì)胞應(yīng)用

簡介：Accusizer780測試紅細(xì)胞和白細(xì)胞的粒徑分布和顆粒計數(shù)

傳統(tǒng)上，紅細(xì)胞和白細(xì)胞的計數(shù)分布都是通過電阻法測試的。粒子分散在導(dǎo)電介質(zhì)中，當(dāng)粒子通過一個小孔時會導(dǎo)致電阻的增加、電導(dǎo)率的下降，電阻的響應(yīng)值與粒子大小和體積有關(guān)。雖然這項技術(shù)多年來應(yīng)用良好，但本文可證明，使用SPOS（單粒子光學(xué)傳感技術(shù)）結(jié)合自動稀釋的顆粒計數(shù)器可更容易地確定紅細(xì)胞和白細(xì)胞的粒徑大小，與電阻法相比，可用的稀釋劑種類更多，限制更小。

Accusizer780采用光阻法，單粒子光學(xué)傳感技術(shù)(SPOS)的原理，可同時測試粒徑分布和顆粒計數(shù)。傳感器內(nèi)部有一個激光，單個粒子在經(jīng)過光感區(qū)域時，對激光造成遮擋，從而導(dǎo)致光強(qiáng)度下降，光強(qiáng)的減弱與粒子的橫截面積成比例。Accusizer780配置有自動稀釋模塊，當(dāng)樣品濃度過高，導(dǎo)致多個粒子可能同時通過傳感器感應(yīng)區(qū)域(這個概率與顆粒濃度有關(guān))，此時樣品會被自動稀釋。儀器可允許稀釋后的樣品在短時間間隔內(nèi)同時計數(shù)粒子（500,000#/min），而避免粒子間的重合效應(yīng)，這意味著粒子間不會相互遮擋，一次計數(shù)一個粒子，得到真實的粒度分布和統(tǒng)計精度。這其中僅需一條校準(zhǔn)曲線即可將脈沖電壓轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的粒徑，不需要復(fù)雜的數(shù)學(xué)算法。由于儀器具有自動稀釋的能力，且一次計數(shù)一個粒子，因此可確定所有經(jīng)過傳感器的粒子都會被統(tǒng)計在內(nèi)，且不會造成重復(fù)計數(shù)。這種測試方式?jīng)Q定了儀器在粒徑分布上的高分辨率，尤其對于粒徑主體分布小于1um的樣品，可觀測到尾端粒子的復(fù)雜分布情況。如前所述，Accusizer780顆粒計數(shù)器不僅能得到樣品的粒徑分布，還能做到顆粒計數(shù)。

本文采用配有自動稀釋功能的Accusizer780進(jìn)行實驗，用來測試一種新儀器的效率，該儀器可將血細(xì)胞的主要成分進(jìn)行分離。在大多數(shù)醫(yī)院，血細(xì)胞都是用電阻法進(jìn)行顆粒計數(shù)分析。電阻顆粒計數(shù)器由兩個電極，電解質(zhì)鹽溶液，一個帶有小孔的非導(dǎo)電玻璃罩組成，電荷可從一個電極流向另一個電極。血液樣品注入樣品池的一端后，由于玻璃小孔一端的壓力差不同，液體會流經(jīng)小孔，從而導(dǎo)致電極間的電荷流動，相應(yīng)的電流會發(fā)生變化，或維持電流不變，電壓增加，電壓或電流的響應(yīng)值與樣品池的排除體積成比例。通過這種方法，可確定血細(xì)胞的粒徑分布和顆粒濃度。

電阻法有以下缺陷：① 電阻法要求樣品懸浮在高導(dǎo)電率的分散劑中，這大大增加了操作成本；② 玻璃小孔很容易堵塞；③ 小孔的規(guī)格很小，會限制樣品的流經(jīng)速度，從而限制粒子的計數(shù)速率，以上這些因素都限制了電阻法測試血細(xì)胞的粒度分布和計數(shù)的使用。Accusizer780則沒有以上問題存在，該技術(shù)基于光阻法的原理，任何合適的稀釋劑都可使用。這一點對于血細(xì)胞分離裝置很重要，因為它需要多種不同的緩沖液來實現(xiàn)不同程度的分離，而其他離子的存在會對分離產(chǎn)生不利影響。Accusizer780的樣品流動池與紅細(xì)胞和白細(xì)胞(凝塊及其他大的凝聚物)的大小相比，流動池的尺寸很大，因此很少發(fā)生堵塞。重要的是，儀器的稀釋速度可高達(dá)120ml/min，對于來自分離器的高濃度血液成分，可做到快速的自動稀釋以及顆粒計數(shù)。

該實驗測試的樣品為血細(xì)胞，范圍從紅細(xì)胞居多的成分到白細(xì)胞居多的成分，總共分析了六個組分，命名從4到9。在“AN160”文獻(xiàn)中，通過對樣品4的zeta電位的檢測可確定，樣品4中幾乎是紅細(xì)胞，而5~9號樣品則分別含有越來越多的白細(xì)胞。

圖1顯示了Accusizer780測試不同樣品的粒徑分布圖：

 圖1：不同組分的血液樣品疊加圖

除4號樣品外，其他樣品的粒徑分布均由兩個窄峰組成。首峰的粒徑在8.5um左右，是紅細(xì)胞的粒徑大小，第二個峰粒徑分布在11-12um左右，與白細(xì)胞的粒徑大小匹配，所以可識別紅細(xì)胞（首峰）和白細(xì)胞（第二個峰）的粒度分布及濃度占比。需注意的是，在圖1中，第二個峰的濃度分布在樣品4中幾乎為0，但后續(xù)幾個樣品中數(shù)目越來越大。首先，這說明樣品4實際上是紅細(xì)胞，其次這一數(shù)據(jù)還表明，其他樣品中的白細(xì)胞組分變得更加豐富。圖2繪制了白細(xì)胞與紅細(xì)胞的體積和計數(shù)的比率圖。

圖2：a. 紅細(xì)胞與白細(xì)胞的體積占比圖  b. 紅細(xì)胞與白細(xì)胞的數(shù)目占比圖

圖2a為峰2與峰1的體積占比，圖2b為峰2與峰1的數(shù)目占比，這些數(shù)據(jù)可表明血液分離裝置將紅細(xì)胞和白細(xì)胞分離的程度大小。值得一提的是，樣品4中的紅細(xì)胞與白細(xì)胞的數(shù)目占比約為500:1（圖中顯示為0.002），但樣品5-9中，占比在逐漸增加（樣品9的比率接近0.3，約是正常值的100倍），這進(jìn)一步說明了分離裝置的效率。這一數(shù)據(jù)還表明，Accusizer780可以用于定量測量樣品中紅血球和白細(xì)胞的相對數(shù)量。

若使用電阻法測試白細(xì)胞數(shù)量，則在測試前須先溶解（破壞）紅細(xì)胞，因為紅細(xì)胞的數(shù)量往往會使白細(xì)胞的計數(shù)變得更困難及不。*，溶解會對紅細(xì)胞和白細(xì)胞造成影響，使得紅細(xì)胞幾乎被破壞，而白細(xì)胞的細(xì)胞膜則被剝?nèi)ゲF(tuán)聚在一起，形成不同的顆粒。圖3測試了樣品6在溶解后的粒度分布，在6-7um處出現(xiàn)一個單峰，且顆粒數(shù)目大大減少。根據(jù)我們已知的化學(xué)溶解效應(yīng)，圖3中的分布粒徑是白細(xì)胞溶解后的殘留，而實際存在的第二個窄峰在溶解后就消失了。

綜上所述，本文提供的數(shù)據(jù)表明，SPOS可以同時測試紅血球和白細(xì)胞的粒徑分布和顆粒濃度。此外，還可配置自動稀釋模塊對樣品進(jìn)行自動稀釋，用這種方法可在不溶解紅細(xì)胞的前提下，對紅細(xì)胞和白細(xì)胞進(jìn)行定量分析。研究表明，溶解會破壞紅細(xì)胞，但只會將白細(xì)胞的粒徑大小從12um降低到6.5um左右。