1. 引言
雖然 DLS 在制藥行業(yè)廣泛使用,但關(guān)于方法開發(fā)和驗證主題的文章很少。提及 DLS 的藥典測試是 USP<729>脂質(zhì)注射乳劑中的球體大小分布。1 因此,本文提供了有關(guān)在制藥行業(yè)中使用 DLS 的一些見解。
2. USP<729>
此標準要求使用 100、250 和 400 nm 三個尺寸規(guī)格的 PSL 標準粒子來驗證 DLS 系統(tǒng)。本文作者不理解為什么選擇這些粒徑,尤其是合格/不合格的標準是 500 nm。
許多使用DLS 的專家認為,僅以一種粒徑進行測試應該即可驗證系統(tǒng)是否正常運行。對這些標準進行3次測量,強度加權(quán)平均粒徑和標準偏差應與預期值在可接受的誤差范圍內(nèi)一致。而可接受的度是根據(jù)“在可接受的誤差范圍內(nèi)"給出的。也許平均粒徑在 ±10% 的范圍內(nèi)是合理的。
系統(tǒng)適用性部分指出,如果 CV 不超過 10%,則分析標準品時的重現(xiàn)性符合標準。通過 USP<729>測試要求強度平均粒徑小于 500 nm (0.5 µm) 并且卡方值 (x2) 保持“可接受的低"。Nicomp® 用戶手冊指出,良好的高斯結(jié)果的卡方值低于2 - 3。因此卡方值<3 表示通過結(jié)果。
3. 質(zhì)量標準說明
因為USP<729>測試是使用 DLS 的藥典專著,其質(zhì)量標準設(shè)定值得考慮,但藥典質(zhì)量標準不一定適合所有藥物。一種更常見的規(guī)范方法是定義強度平均值的值和范圍以及與分布寬度相關(guān)的一些計算。DLS 的 ISO 標準建議關(guān)注強度平均值和多分散性指數(shù)(PI)。2
作者看到的一些 DLS 規(guī)格包括 D10、D50 和 D90 的值。這些值可能來自制藥行業(yè)廣泛使用激光衍射進行粒度分析。USP<429>測試光衍射測量粒徑3經(jīng)常使用 D10、D50 和 D90。設(shè)置質(zhì)量標準的另一種方法是從USP<429>中借鑒重現(xiàn)性相關(guān)內(nèi)容, USP<429>中“重復"部分給出的基于體積分布的重現(xiàn)性范圍為:
● D50 = 10%
● D10, D90 = 15%
● 在 10 µm 以下,這些最大值可以加倍
遵循這些指南的內(nèi)容,DLS 規(guī)格(根據(jù)定義尺寸小于 10 µm)對于強度平均值可以是可重復的 ±20%,對于 PI 或其他計算結(jié)果指示分布寬度是可重復的 ±30%。對于某些藥品,這可能是一個可以接受的范圍,但要注意當粒徑非常小時出現(xiàn)的統(tǒng)計問題。如果平均粒徑為 500 nm,±20%,則范圍為 400 – 600 nm,這還不錯。但對于平均粒徑為 10 nm 的蛋白質(zhì),范圍則為 8-12 nm,這樣的粒徑跨度變得非常挑戰(zhàn)且難以接受。
4. 分析方法開發(fā)
在開發(fā)方法之前,需要調(diào)查樣品制備問題。這可以從簡單的(將樣品移入比色皿中)到復雜的(用表面活性劑和超聲波分散)。樣品制備的主題超出了本文檔的范圍,但已在之前的技術(shù)說明中討論過。4 使用 DLS 制備樣品進行分析時需要考慮的一些建議包括:
—— 測試濃度的影響。測量、稀釋并再次測量。
—— 測試測量時間的影響。測量 3、5 和 10 分鐘。
—— 確保任何稀釋劑都經(jīng)過充分過濾。WFI 可能不夠干凈。
—— 確保使用樣品池都足夠干凈。
—— 是否應使用過濾器去除樣品中的大顆粒?
—— 哪個樣品池合適。
—— 調(diào)查任何可能影響結(jié)果的儀器設(shè)置。
優(yōu)化樣品制備步驟和儀器設(shè)置后,就可進行測試重復性實驗。調(diào)查分析時間的微小變化是否對結(jié)果有任何重大影響。如果該方法需要 5 分鐘的分析時間,則在 4 分 30 秒和 5 分 30 秒時測試。檢查結(jié)果是否相同。
一旦方法得到優(yōu)化,下一步就是按照標準 FDA 指南記錄該方法。5 目標是足夠詳細地描述程序,以便其他操作員可以執(zhí)行相同的測試并生成相同的結(jié)果。列出了必須包含的基本信息:
—— 原理/范圍:分析測試/技術(shù)的基本原理。
—— 裝置/設(shè)備:儀器類型、激光、檢測器、檢測角度和樣品池類型。
—— 操作參數(shù):溫度、粘度、分析時間和通道寬度。
—— 試劑/標準品:用于驗證性能的聚苯乙希乳膠 (PSL)。PSS 建議使用 90 nm PSL(請參閱 Entegris 技術(shù)說明 - 系統(tǒng)驗證)。
—— 標準控制溶液制備:稀釋劑,稀釋。6
—— 程序:程序的逐步描述。將準備好的樣品放入比色皿中,放入到系統(tǒng)中,定義參數(shù)并進行測量。
—— 系統(tǒng)適用性:測試以確保系統(tǒng)在使用時能夠正常運行。6
—— 計算:所有結(jié)果計算通常直接在DLS 系統(tǒng)操作系統(tǒng)軟件中進行。8 可以在電子表格中進行額外的統(tǒng)計計算。
—— 數(shù)據(jù)報告:數(shù)字數(shù)據(jù)、格式、有效數(shù)字的表示。Entegris 建議將結(jié)果重點放在光強強度加權(quán)平均直徑上。
5. 關(guān)于參考標準和材料的說明
如上所述,我們認為單個粒徑的測試足以驗證系統(tǒng)是否正常運行。多家供應商提供多種粒徑標準品,客戶可以選擇他們推薦使用的樣品。但Entegris對兩種 PSL 標準粒子擁有豐富經(jīng)驗,這些也是我們通常建議客戶用來驗證其 Nicomp6 的樣本。Thermo Fisher 3000 系列 NIST 可溯源 90 nm 標稱 PSL 標準通常用于驗證 Nicomp 性能。樣品的目錄號為 3090A,認證值為 92 ± 3 nm。另一個經(jīng)常使用的樣品是 Thermo Fisher 目錄號 5009A,值為 90 nm。該樣品不可追溯到 NIST,但我們有足夠的經(jīng)驗推薦使用該樣品,而且它比 3000 系列產(chǎn)品便宜。
注:DLS 是一種不需要校準的第一原理技術(shù)。該系統(tǒng)使用一種或多種 PSL 標準進行驗證。如果系統(tǒng)未通過驗證步驟,則無法進行調(diào)整以使結(jié)果進入預期范圍。驗證結(jié)果失敗可能是由于系統(tǒng)工作不正常而需要維修,或者更常見的是標準粒子準備不當,應在嘗試另一次測量之前重新準備。
6. 儀器介紹
參考資料
1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions
2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)
3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size
4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation
5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015
6 Entegris Technical Note, DLS System Verification
7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.
8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation