1.  引言

高濃度制劑是指最終的單抗蛋白濃度大于100 mg/mL的制劑。目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的單抗產(chǎn)品中有大約三分之一是高濃度制劑（＞100mg/mL）。^[1]高濃度制劑可降低西林瓶的灌裝體積，節(jié)約生產(chǎn)成本，減少注射時(shí)間，提高患者依從性。

注射劑中的顆粒檢測(cè)是注射劑質(zhì)量控制的重要項(xiàng)目，影響著注射劑的安全性及有效性。顆粒主要包括可見(jiàn)顆粒和亞可見(jiàn)顆粒（sub-visible particle，SbvP），美國(guó)藥典USP<788>和中國(guó)藥典CP0903中均對(duì)注射劑亞可見(jiàn)顆粒（不溶性微粒）的檢測(cè)方法和限度進(jìn)行了明確的規(guī)定。針對(duì)抗體注射劑，美國(guó)藥典USP<787>和USP<1787>對(duì)其亞可見(jiàn)微粒進(jìn)行了補(bǔ)充說(shuō)明。

與常規(guī)注射劑相比，高濃度抗體藥物制劑具有注射體積小（通常為2mL）^[2]等特點(diǎn)，現(xiàn)有檢測(cè)方法在檢測(cè)小容量的單劑量包裝樣品具有一定的局限性；高濃度抗體藥物制劑的理化性質(zhì)相較于常規(guī)注射液也出現(xiàn)了變化，蛋白質(zhì)濃度的增加使短距離相互作用的影響越來(lái)越大，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用變得顯著，增加了制劑的黏度。黏度、流動(dòng)性差等特點(diǎn)使其在亞微粒檢測(cè)混合和抽取時(shí)有一定影響；由于高濃度抗體制劑的分子間結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，更易產(chǎn)生自締合（Self- association）和聚集（Aggregation），相較于常規(guī)SbvP檢測(cè)的光阻法，流動(dòng)成像法因可區(qū)分某些類型的顆粒而廣泛應(yīng)用于聚集體的檢測(cè)。

2.  顆粒粒徑/計(jì)數(shù)技術(shù)

高濃度抗體藥物制劑的顆粒來(lái)源主要有三類：

1）外源性顆粒，指與生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品成分無(wú)關(guān)的顆粒；

2）內(nèi)源性顆粒，來(lái)源于生產(chǎn)原料、包材以及生產(chǎn)工藝的操作中所產(chǎn)生的亞可見(jiàn)微粒，如膠塞上脫落的碎片、預(yù)充針的硅油涂層和玻璃碎片等；

3）固有性顆粒，即產(chǎn)品自身產(chǎn)生的顆粒，如蛋白聚集與表面活性劑膠束形成的顆粒。

由于存在多種潛在的顆粒來(lái)源，因此識(shí)別顆粒并確定顆粒來(lái)源有利于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和應(yīng)用評(píng)估。如果研發(fā)時(shí)測(cè)試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)限度出現(xiàn)偏差，顆粒識(shí)別將指導(dǎo)原因分析、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、糾正措施、調(diào)整控制策略等多個(gè)環(huán)節(jié)。^[3]

美國(guó)藥典推薦使用光阻法作為檢測(cè)抗體注射劑中不溶性微粒的檢測(cè)的方案[4],相較于常規(guī)的注射劑，高濃度抗體注射劑在使用光阻法需注意：

1）粒度分布的分析取決于所使用的儀器及其校準(zhǔn)方法，目前常用于校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)粒子均為球體，但蛋白質(zhì)顆粒通常具有不規(guī)則的形態(tài)，等效球體模型下可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)粒徑檢測(cè)有一定的影響。

2）小體積檢測(cè)分析方法開(kāi)發(fā) 高濃度抗體注射劑具有注射體積小的特點(diǎn)，無(wú)法直接用于常規(guī)儀器的檢測(cè)，需將幾個(gè)樣品混合獲得可供測(cè)試的樣品，美國(guó)藥典USP<788>規(guī)定需混合得到25ml的樣品，每次取樣5mL,共檢測(cè)4次，統(tǒng)計(jì)≥10μm 和≥25μm的顆粒濃度，舍去第1次測(cè)定結(jié)果，取剩下3次測(cè)定結(jié)果平均值為最終結(jié)果。

此外美國(guó)藥典USP<787>中專門針對(duì)治療性蛋白質(zhì)注射劑和相關(guān)制劑進(jìn)行了補(bǔ)充說(shuō)明，允許使用較小的測(cè)試產(chǎn)品體積來(lái)進(jìn)行不溶性微粒的檢測(cè)。對(duì)于沒(méi)有足夠體積的產(chǎn)品，可將適當(dāng)數(shù)量的產(chǎn)品混合在一個(gè)單獨(dú)的容器中，以獲得單次測(cè)試所需的體積(通常為0.2-5.0 mL)。AccuSizer A2000 系列儀器可以提供小體積檢測(cè)方案，以下檢測(cè)方案僅供參考：

通過(guò)與常規(guī)檢測(cè)方法的對(duì)比，我們建議在小體積檢測(cè)分析方法開(kāi)發(fā)上可進(jìn)行如下改進(jìn)：①使用微升級(jí)別進(jìn)樣量、降低流速；②使用小體積注射器，保證體積精度；③重新校準(zhǔn)曲線保證數(shù)據(jù)精確度。

3）大多數(shù)高濃度抗體藥物需冷藏儲(chǔ)存，如采用較低溫度直接檢測(cè)，與管路中殘留不同溫度液體間將發(fā)生熱量傳遞，造成液流紊亂；

4）中美藥典均為≥10μm和≥25μm的顆粒制定了明確的標(biāo)準(zhǔn)限度，對(duì)于分子量較大的蛋白質(zhì)藥物，分子聚集之后產(chǎn)生的顆粒在免疫學(xué)方面存在隱患。Carpenter等人認(rèn)為0.1-10μm 范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)不溶性微粒潛在免疫原性風(fēng)險(xiǎn)存在不確定性，測(cè)量<10 μm尺寸范圍內(nèi)的不溶性微粒物有助于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和表征。^[5]

3.  現(xiàn)行光阻法的優(yōu)化方案

儀器優(yōu)化設(shè)計(jì)^[6]：光阻法顆粒計(jì)數(shù)儀器可通過(guò)儀器設(shè)計(jì)滿足不同的應(yīng)用目的。

1）如果在檢測(cè)器流通池不變的基礎(chǔ)上減少測(cè)樣體積，可通過(guò)如下方式：

• 取樣針的內(nèi)徑變小

• 取樣針的長(zhǎng)度變短

• 減少取樣針尖與測(cè)樣容器底的距離

• 取樣針為平頭型設(shè)計(jì)

• 軟件中支持設(shè)置不同取樣體積，即包括最滴取樣體積

• 支持基于取樣針中心點(diǎn)的平底容器的傾斜放置樣品固定模塊

2）如果要減少測(cè)樣過(guò)程中氣泡的產(chǎn)生，設(shè)計(jì)如下

• 可調(diào)節(jié)抽取樣品速度

• 平頭取樣針

• 測(cè)樣流通池孔徑小于取樣針的內(nèi)徑

AccuSizer A2000 系列不溶性微粒檢測(cè)儀，采用PFA材質(zhì)進(jìn)樣管，進(jìn)樣管管內(nèi)內(nèi)徑可選，長(zhǎng)度可調(diào)，可使用平頭取樣針，可用于不同規(guī)格的試劑瓶，軟件可以調(diào)節(jié)不同的進(jìn)樣體積，近透明的材質(zhì)更方便觀察是否抽取到氣泡。

A2000 系列單個(gè)傳感器檢測(cè)范圍為：0.5μm~400μm，傳感器濃度上限10000個(gè)/mL，具有512數(shù)據(jù)通道，分辨率高。模塊化設(shè)計(jì)，維護(hù)升級(jí)便利，如樣品檢測(cè)量多，可選配自動(dòng)進(jìn)樣器，可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)進(jìn)樣。

圖1 AccuSizer A2000 系列不溶性微粒檢測(cè)儀

4.  新型SbvP檢測(cè)方法

不溶性微粒的來(lái)源有多種，分辨微粒的來(lái)源有利于開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的控制策略，但常規(guī)SbvP檢測(cè)的光阻法無(wú)法辨別不溶性微粒的形態(tài)，無(wú)法確定微粒的來(lái)源。2017年USP40<1788>收錄不溶性微粒檢測(cè)第三法——流動(dòng)成像法（Flow Imaging method, FIM），流動(dòng)成像法結(jié)合微流體和光學(xué)顯微鏡技術(shù)，可快速大量地自動(dòng)捕捉圖像，這些圖像可以用來(lái)分析生物治療樣品中顆粒的濃度、大小分布及形態(tài)。

聚集蛋白具有半透明、折光率低等特點(diǎn)，在使用光阻法（Light Obscuration method, LO）進(jìn)行不溶性微粒測(cè)試時(shí)，可能無(wú)法檢測(cè)出透明度較高、對(duì)光不敏感的蛋白粒子。對(duì)于聚集蛋白，流動(dòng)成像法獲得的粒子濃度將比光阻法獲得的粒子濃度更準(zhǔn)確^[7]。但光阻法仍然是評(píng)估顆粒負(fù)荷的一個(gè)重要工具，因?yàn)椋?

1. 光阻法儀器具有高可靠性和可重復(fù)性；

2. 對(duì)非美國(guó)市場(chǎng)的監(jiān)管要求可能需要使用光阻法；

3. 藥品的光阻法測(cè)試有悠久的歷史和重要的積累的經(jīng)驗(yàn)，測(cè)量的顆粒濃度的歷史值很容易與當(dāng)代的光阻法測(cè)量值進(jìn)行比較。

綜上所述，采用光阻法為主，流動(dòng)成像法為輔的不溶性微粒檢測(cè)方法更有利于產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和質(zhì)量監(jiān)控。

FlowCam8000系列流式成像顆粒分析系統(tǒng)

流式成像顆粒分析系統(tǒng)（FIM）將數(shù)字成像、流式細(xì)胞技術(shù)和顯微鏡的優(yōu)勢(shì)結(jié)合在單個(gè)解決方案中。除了測(cè)量傳統(tǒng)的粒子大小和數(shù)量，通過(guò)分析圖像還可以表征生物藥品、蛋白樣品、注射液、細(xì)胞、浮游微生物等中的亞可見(jiàn)顆粒（不溶性微粒）。

圖2 FlowCam 8000 流式成像顆粒分析系統(tǒng)

5. 在藥品全生命周期中對(duì)SbvP進(jìn)行監(jiān)管

早期研發(fā)階段和后期工藝階段可使用多種檢測(cè)方法對(duì)顆粒進(jìn)行全面的表征分析，對(duì)比不同方法間差異性，監(jiān)控顆粒的形成途徑，來(lái)源及變化趨勢(shì)，為處方工藝開(kāi)發(fā)提供參考；

后期研發(fā)階段的重點(diǎn)是了解產(chǎn)品不同批次之間的可比性，以及顆粒結(jié)果與配方、制造和使用等因素之間的關(guān)聯(lián)性，如應(yīng)監(jiān)測(cè)臨床批次1~100 μm范圍內(nèi)的顆粒數(shù)量與大??；應(yīng)收集在儲(chǔ)存、使用和壓力條件下形成的不溶性微粒物的定量和定性數(shù)據(jù)，并制定風(fēng)險(xiǎn)控制策略；在最終選擇監(jiān)測(cè)產(chǎn)品顆粒大小和計(jì)數(shù)的方法時(shí)，應(yīng)分別建立內(nèi)源性顆粒、外源性顆粒及固有性顆粒的控制策略。

藥典的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)是最滴標(biāo)準(zhǔn)，與對(duì)微粒危害的認(rèn)識(shí)和監(jiān)測(cè)需求相比具有滯后性，因此，在內(nèi)控時(shí)也應(yīng)嘗試從多種粒徑水平、多種檢測(cè)方法對(duì)顆粒進(jìn)行全面表征和分析，積累數(shù)據(jù)，以便為增加放行方法和提升放行要求提供依據(jù)，也為不良反應(yīng)原因回溯提供數(shù)據(jù)支持。^[8]如下是SbvP在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的檢測(cè)策略，供參考。

表1 SbvP在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的檢測(cè)策略^[6]

參考資料

[1] 淺析高濃度制劑開(kāi)發(fā)面臨的挑戰(zhàn)和解決方案 || 抗體藥研發(fā)問(wèn)答，抗體君（公眾號(hào)）

[2] BADKAR AV，GANDHI RB，DAVIS SP，et al．Subcutaneous delivery of high-dose /volume biologics: current status and prospect for future advancements［J］．Drug Des Devel Ther，2021，15: 159-170

[3] USP 1787

[4] USP 787

[5] Satish K Singh, Nataliya Afonina, Michel Awwad, et al. An Industry Perspective on the Monitoring of Subvisible Particles as a Quality Attribute for Protein Therapeutics[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences，2010，99（8）： 3302-3321.

[6] 丁毅,張雅婷,郭歡歡,熊菲,紀(jì)仁智,邱波.高濃度抗體藥物制劑的亞可見(jiàn)顆粒檢測(cè)方法優(yōu)化和操作策略[J].中國(guó)新藥雜志,2022,31(08):762-766

[7] USP 1788

[8] 郭莎,賈哲,吳昊,王蘭.單克隆抗體顆粒表征的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)[J].中國(guó)藥事,2022,36(02):161-169.